化學方法合成DNA片段是壹種十分成熟和簡便的技術，利用DNA合成儀，根據待合成的DNA片段預定的核苷酸序列，可自動地將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。目前常用此方法合成引物、寡核苷酸接頭（linker）以及基因片段等。
根據某基因測定的核苷酸序列，或者根據蛋白質氨基酸序列推導的核苷酸序列，可以化學合成相應的基因片段。不同的是組成基因的DNA片段壹般比較長，先必須按基因的核苷酸序列化學合成幾個200bp左右的DNA片段，然後采用酶促連接法再組裝成為含完整目的基因的DNA片段。
主要包括磷酸二酯法和亞磷酸三酯法兩種方法合成基因生段，磷酸二酯法的基本原理是，將兩個分別在5′-或3′-末端帶有適當保護堿基的脫氧單核苷酸連接起來，形成壹個帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸；亞磷酸三酯法原理是將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3′-末端先以3′-OH與壹個不溶性載體，如多孔玻璃珠（CPG）連接，然後依次從3′-5′的方向將核苷酸單體加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團都是經過保護的，合成反應的壹個循環周期分為脫保護基、偶聯反應、封端反應和氧化作用四步反應。
化學合成寡聚核苷酸片段的能力壹般局限於150200bp，而絕大多數基因的大小超過了這個範圍，需要將較長的基因先幾個合成較短的寡核苷酸片段後，再適當連接組裝成完整的基因，而這往往使基因制備難度加大，而且化學基因合成相比之下比較價格昂貴，因此這種方法主要適用於已知核苷酸序列的、分子量較小的目的基因的制備。對於較長的基因的合成，可根據基因或氨基酸序列，將化學合成寡核苷酸方法與酶促合成DNA的方法結合起來，也可進行基因的人工合成，具體的操作為：首先化學合成多個含有80100個核苷酸的寡聚核苷酸；每個寡聚核苷酸片段之間有1924個核苷酸的重疊序列；再將各個寡聚核苷酸等量（摩爾濃度）混合，在DNA聚合酶（或emphasis：role=italicTaqemphasis酶）作用下，通過重疊延伸拼接技術（sequence：overlapped：extension，SOE-PCR），各寡聚核苷酸又作為模版，使單鏈部分補齊成為雙鏈；DNA變性成單鏈，各單鏈寡聚核苷酸片段之間仍有1924個核苷酸的重疊序列，兩個單鏈部分再經SOE-PCR補齊，獲得雙鏈。