因此,為了滿足國家對保證和提高重要藥用植物質量的需求,以及中藥野生資源短缺和質量嚴重退化的嚴峻形勢,必須更好地開發和利用藥用植物資源,改善和提高其質量,提高工業生產率,增加藥用物質的產量以滿足市場需求,同時增加對野生資源的保護,使其更好地和可持續地為人類所用。
藥用植物的開發利用存在種類和數量不清、種質資源保存困難、野生資源破壞嚴重、人工栽培品種質量下降等諸多問題,嚴重制約了產業發展。如何有效地對藥用植物資源進行分類鑒定,保護瀕危和稀缺資源,修復再生,防止退化和滅絕,從而保證藥材的可持續供應,提高藥材質量,是現代藥用植物開發領域最迫切的任務,也是實現中藥產業現代化和國際化的關鍵舉措。
傳統的藥用植物分類鑒定方法主要是根據藥材的感官特征,如顏色、形狀、氣味、味道、質地等。它們的缺點是對這些特征的把握因人而異,主觀性強,強調經驗積累,準確性不強,沒有得到國際同行的廣泛認可。因此,如何在分子水平上揭示種質間的差異成為研究者非常關心的問題。現代生物技術為藥用植物種質鑒定開辟了新的途徑。
DNA分子標記基於DNA分子差異,壹般具有快速、微量、特異性強、穩定性好、結果直觀可靠、不受生長階段、檢測場所、環境條件、儲存等因素影響等諸多優點[1]。
DNA分子標記在藥用植物研究中的應用最早始於日本。最早也是應用最廣的是藥材的真偽鑒別和品種分類。早期的DNA分子標記技術包括限制性片段長度多態性(RFLP)和隨機擴增多態性DNA (RAPD)。隨著生物技術的發展,更加高效、快速的DNA分子標記相繼出現,如擴增限制性片段多態性(AFLP)、簡單序列重復(simple sequence repeat)、SSR、序列特征擴增區(SCAR)、簡單序列重復(simple sequence repeat)、ISSR、序列相關擴增多態性(SRAP)、單鏈構象多態性(SSCP)等,並應用於藥用植物種質資源研究的各個方面。
臺灣省中興大學用RFLP技術準確鑒別苦參及其混淆品[2],紀寶玉等人對葛根的研究[3]表明RAPD可作為種質資源篩選鑒定的關鍵技術;郝剛平[4]成功地將AFLP技術應用於丹參的道地性鑒定;潘清平等[5]利用ISSR技術為玉竹商品藥材的鑒別提供了分子基礎。因此,DNA分子標記技術是鑒定藥用植物的有效方法。
表1比較了幾種常用的DNA分子標記技術,每種方法都有各自的優勢和局限性。在實際應用中,可以根據實驗目的、材料和實驗條件進行選擇。
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DNA條形碼是用壹個或幾個標準的DNA序列作為標記來識別物種,類似於超市用條形碼掃描來區分不同的商品。它具有快速、簡單、準確、可靠和自動化的優點。
陳等[6]研究了4 800種藥用植物及其近緣種的6 600個樣品,證明了在藥用植物的鑒定中起著關鍵作用。劉梅子等[7]發現ITS2序列在鑒別9種不同地區采集的常見蒿屬植物中成功率最高,可作為鑒別蒿屬植物的潛在條形碼;崔誌偉等人[8]利用ITS2和psbA-tmH有效地區分了金銀花的不同品種,說明ITS2和psbA-tmH可以作為鑒別金銀花不同品種的優勢條形碼組合;李等人[9]對海南茜草科植物的鑒定研究表明,序列可用於海南茜草科植物的快速鑒定。
近年來新發展起來的單核苷酸多態性(SNP)標記技術,可以只檢測個體堿基差異或只檢測不同等位基因之間的插入和缺失等微小的核苷酸差異,從而區分兩個個體的遺傳物質差異[10]。陳等[11]利用SNP標記技術結合、matK和psbA-trnH標準條形碼序列成功鑒別了高麗參和西洋參。證明基於DNA條形碼的SNP標記技術可以作為鑒別人參的有效手段。SNP可通過序列變異直接標記,其檢測分析方法以尖端的DNA芯片技術取代傳統的凝膠電泳,被認為是最具應用前景的遺傳標記。
DNA條形碼技術能夠快速有效地鑒定物種,已成為藥用植物種質資源分類鑒定的主流方法。
傳統藥用植物種質資源壹般采用種子庫保存,存在占用空間大、保存種類有限、管理麻煩、易感染黴變、保存時間短等缺點。利用生物技術進行體外保存可以很好地解決上述問題。保存下來的材料復活後,可在短時間內快速繁殖大量種苗,不受自然環境影響,省時省力,減少變質頻率,達到隨時使用,長期保存優質種質資源的目的[12]。
根據植物細胞的全能性,將外植體接種於MS半固體培養基或液體培養基濾紙上,然後在室溫或低溫下培養,並及時繼代培養[13]。組織培養保存方法分為室溫繼代培養保存方法和緩慢生長保存方法。組織培養保存法可以有效擴大藥用植物的繁殖,緩解野生資源不能滿足市場需求的局面,也是保護瀕危珍稀藥用植物的有效手段。
(1)常溫繼代培養法:常溫下,外植體每隔壹定時間進行新壹輪繼代培養,達到保存種質的目的,必要時可隨時繁殖[14]。利用該方法保存鐵皮石斛種質資源取得了壹定的效果,成功建立了鐵皮石斛快速繁殖體系[13]。這種方法間隔時間短,需要連續傳代培養。
(2)緩慢生長保存法:通過調整培養條件,在不造成死亡的情況下,抑制外植體的生長,盡可能減少營養物質的消耗,從而盡可能延長繼代培養時間。主要措施有降低溫度、調節滲透壓、控制營養水平、使用生長抑制劑或緩凝劑、控制培養基中營養物質的比例和調節光照[13]。金銀花的離體培養。研究了金銀花離體保存的最適條件。種質資源發掘[15]。
這種方法可以長期保存植物種質,不需要繼代培養,所以遺傳變異比較小。目前最成熟的冷凍保存方法是玻璃化法。將植物培養物用高濃度復合保護劑處理壹定時間,然後用液氮快速冷凍,使植物細胞內外的溶液凝固成無定形的玻璃化狀態,避免冰晶在形成和融化過程中對細胞造成的機械損傷。在這種狀態下,植物細胞內的代謝和生長活動幾乎完全停止,而生物材料的形態發生潛力得以保持[16],這是保存種質的有效方法。
西洋參懸浮細胞超低溫保存的探索性研究證明了該方法的可行性[17];包埋玻璃化超低溫保存技術可實現山藥種質的離體保存[18];通過玻璃化保存瀕危植物矢車菊,成功實現了其莖尖的冷凍程序[19]。
在滴凍法和玻璃化法基礎上發展起來的滴玻璃化法具有成活率高、再生率高、適應性廣、容量大、操作簡單等優點[20]。微滴玻璃化在藥用植物種質保存中的應用報道較少,但在其他植物中的應用可作為參考。
人工種子是通過組織培養產生的胚狀體,包裹在可以提供營養的膠囊中,然後塗上壹層保護膜,形成類似於天然種子的結構。人工種子具有不受季節限制、較好的營養供給和抗病性、保持優良品種的遺傳特性、便於儲存和運輸等優點。這對瀕危藥用植物種質資源的保存具有重要意義。
長期以來,許多珍稀藥用植物因其獨特的治療、保健、美容功效而供不應求,原材料藥材價格持續上漲,極大地刺激了人們對野生珍稀藥用植物資源的掠奪性開采和收購,對資源造成毀滅性破壞。此外,全球變暖等自然環境的變化也使得許多地區不再適合原生藥用植物的生長。由於各種原因,多種珍稀藥用植物資源瀕臨滅絕。
人工種子技術對於瀕危植物種質資源的保存具有重要意義。但這種技術依賴於植物組織培養,不適合難以培養的植物。
利用器官培養、植物幹細胞培養等生物技術方法[30]也可以實現藥用植物資源的可持續利用。此外,DNA分子標記技術在種質資源鑒定、保護對象和就地保護單位的確定、遷地保護的取樣策略和效果評價、瀕危原因的科學闡明等方面的應用,也可以為珍稀瀕危藥用植物資源保護策略和措施的制定提供參考。
生物技術的應用不僅可以更好地開發利用藥用植物資源,而且可以最大限度地保護它們。生物技術將在向世界推廣中國文化瑰寶——中醫藥方面發揮巨大作用。
藥用植物栽培中存在病毒感染導致品質下降、缺乏科學的品質評價體系等問題。因此,培育無病毒的優質藥用植物,建立科學的質量評價體系,創造品質優於天然品種的藥用植物新品種,是藥用植物研究開發的熱點方向。
植物病毒被稱為“植物癌癥”,因為它幹擾宿主的新陳代謝,降低產量和質量,甚至導致死亡。尤其是無性作物,種植多年後容易積累多種病毒,從而造成品質下降[31]。植物病毒已成為降低農作物產量和品質的主要因素之壹。
目前,人類發現的植物病毒有近千種。藥用植物感染的病毒主要有黃瓜花葉病毒、芋頭花葉病毒、大豆花葉病毒和煙草花葉病毒[32]。植物病毒每年造成的全球經濟損失約為600億美元。因此,加強藥用植物脫毒技術的研究,采取科學有效的防治措施,是當前和今後增強和提高藥用植物質量的重點和難點[33]。表2總結了近年來幾種解毒技術的應用進展。
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除了表2所列的常見脫毒方法外,還有花藥或花粉培養和珠心胚培養技術,也能在壹定程度上起到脫毒的作用。
植物新品種,是指經過人工培育、引種馴化所發現的野生植物而發展起來的,或者經過生物技術轉化的,在名稱上具有新穎性、特異性、壹致性、穩定性和確定性的植物品種[45]。
傳統藥用植物的新品種通常是通過雜交育種等方法創造出來的。如桔梗[46]和丹參[47]等藥材在雜交育種或雜種優勢利用方面進行了研究,並創造了新品種。然而,這種方法存在壹些缺點,如無法產生新的基因,雜交後代中的性狀分離,育種過程緩慢,過程復雜。現代生物技術開辟了創造新品種的新途徑。
誘變育種是指利用各種物理、化學和生物因素誘導植物發生基因突變,促進基因重組,擴大遺傳變異,然後根據育種目標選擇新品種的育種技術[48]。
離子束註入誘變技術是利用可控、成簇、定向註入範圍的帶電離子束,在對細胞損傷較小的情況下,獲得更高的誘變率和更寬的誘變譜,從而選育出新品種的技術。用不同劑量的12C6+離子束均勻輻照紫蘇種子後,產生了壹定的染色體畸變,為篩選優良變異品種提供了更多的可能性[49]。說明低劑量12C6+重離子束在輻照誘變新類型和培育優良新品種方面有很大潛力。
太空育種是利用特殊的太空環境,使生物基因發生變異,選育新品種和新材料的壹種新型育種技術。其最大的優點是可以在短時間內獲得常規育種和常規誘變育種方法難以獲得的稀有基因資源,使植物獲得新基因、新類型、新性狀[50]。據悉,“田單壹號”太空丹參由天士力集團培育成功。2008年,該組攜帶丹參種子進入太空,返回地面後培育繁育出“田單壹號”太空丹參,其有效成分明顯高於對照。
誘變育種可以提高突變率,在短時間內獲得更多的突變類型,但誘導突變的方向很難控制,大多數突變都是有害突變。要獲得更多的優良性狀,就要增加突變的數量。所以篩選的工作量是相當大的。
倍性育種包括單倍體育種和多倍體育種。單倍體育種是單倍體培養技術與育種實踐相結合形成的壹種新的育種方法,具有克服遠緣雜種不育性,提高育種效率和選擇效率,快速獲得純系的優點[48]。以發育中的菘藍花藥為外植體,通過培養和單倍體誘導獲得單倍體植株。染色體加倍後,壹代即可出現純合二倍體,性狀不分離,表型整齊壹致,可顯著縮短育種周期[51]。
多倍體是指染色體數目為3n或更多的個體、種群和物種。多倍體植物具有更強的適應性和可塑性。藥用植物多倍體具有抗逆性強、生物產量高、肥力低、增加某些藥用成分含量等特點。最常用的多倍體誘導劑是秋水仙堿。秋水仙堿誘導法可分為體內處理倍增法和體外處理倍增法兩種[52]。活體加倍方法有點滴法、浸泡法、瓊脂法、噴霧法、註射法等。體外加倍法,即組織培養誘變法,是用秋水仙堿處理植物的離體部分,然後進行組織培養,或在組織培養過程中染色體加倍的方法。將秋水仙堿和瓊脂混合制成半固體,然後塗抹在植物的頂芽或腋芽上,誘導多倍體。這種方法在桔梗[53]和金銀花[54]等藥用植物中獲得了成功。用適當濃度的秋水仙堿溶液浸泡地黃的芽莖段,也能誘導出四倍體植株,但誘導率不高[55]。將石斛類原球莖接種在含0.075%秋水仙堿的培養基上,獲得了較高的誘導率[56]。體外培養的方法在誘導紫錐菊染色體加倍方面也取得了成功[57]。此外,物理因素如溫度突變、機械創傷、電離輻射、非電離輻射、離心力以及生物方法如有性雜交、胚乳培養、體細胞雜交、體細胞克隆變異等也可用於誘導染色體加倍。
人工誘導多倍體雖然頻率高、見效快、方法簡單,但在生產和育種實踐中能產生巨大的經濟效益。但同時也存在毒性、嵌合體嚴重、繁殖力降低、穩定耗時長、養殖成本高等問題[58]。因此,在藥用植物的多倍體育種中需要進行越來越廣泛的研究。
轉基因育種又稱基因工程育種,是將外源基因重組到受體細胞的基因組中,使其按照人的意願特異性表達,通過篩選獲得穩定表達的基因工程新品種。其主要優點是可以克服植物遠緣雜交的不親和障礙,擴大物種的雜交範圍,加快突變速度,為生物的定向創造提供了可能[59]。它可以在創造新品種和開發各種抗性的優質、高產、高效作物中發揮重要作用。目前植物轉基因的主要方法有農桿菌介導法、聚乙二醇介導法、基因槍法、花粉管通道法、電刺激穿孔法、顯微註射法和超聲波導入法。
農桿菌介導的基因轉化是應用最廣泛、技術最成熟、效果最理想的方法。首先將與目的基因相連的植物表達載體轉入根癌農桿菌,然後用根癌農桿菌感染植物,將載體上的目的基因導入並整合到植物基因組中,從而完成目的基因的轉化,獲得轉基因植物。可用於轉化大的DNA片段,遺傳穩定,重復性好,不易產生基因沈默,但僅對雙子葉植物敏感。該方法已成功應用於丹參[60]、諸葛菜和菘藍[61]、黃芪[62]、青蒿[63]等材料。
基因槍法是繼農桿菌介導轉化後的又壹種廣泛應用的遺傳轉化技術。利用火藥爆炸或其他驅動力,將裝載外源DNA的金屬顆粒射入真空室中的靶細胞或組織,從而導入外源基因。該方法無宿主限制,操作簡單,轉化時間短,但轉化率相對較低,外源DNA的整合機制尚不明確。近年來,在大蒜[64]和白三葉[65]等藥用植物方面取得了新的成就。
花粉管通道法是利用授粉後植物開花時萌發的花粉管通道將外源DNA導入受精卵,然後將目的基因整合到受體植物的基因組中,使其自然發育成種子,形成轉基因植物。這種方法簡單,育種時間短。用該方法轉化鐵皮石斛[66]和蓖麻[67]獲得轉基因新品種。表3比較了幾種主要植物基因轉化方法的特點。
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雖然轉基因在藥用植物中的應用已經取得了相當不錯的成果,但其安全性壹直是爭論的熱點。因此,我們應該謹慎對待轉基因藥用植物,必須進行更系統和深入的研究。
次生代謝工程是通過DNA重組技術改造次生代謝產物的生化反應途徑或引入新的生化反應,從而直接提高或抑制壹種或某些特定次生代謝產物的合成,提高細胞性能。隨著藥用植物次生代謝產物生物合成途徑的發現,應用代謝工程技術對植物次生代謝途徑進行遺傳改良,以大幅提高目標產物的量,已成為研究熱點。
自從美國學者Bailey在1991年提出次生代謝工程的概念以來,次生代謝工程技術的應用已有大量報道。早期最經典的研究就是用這種技術從零開始實現水稻胚乳中的維生素A原(β-胡蘿蔔素)[68]。近年來,關於該技術在藥用植物中應用的報道層出不窮。藥用植物中各種有效物質的含量往往很低,不能滿足人們的需要。它們在植物中的數量可以通過次級代謝工程的方法穩定地增加。簡要介紹了次生代謝工程在藥用植物中幾種重要藥效物質的應用進展。
苯丙素是植物在長期自然選擇過程中產生的壹類重要的天然有機化合物。它們壹般具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗自由基、抗炎鎮痛、保肝護肝、保護心血管系統等多種生物活性,是非常重要的天然藥用物質。