作者 山東巴德生物科技有限公司? 鄭 全博士
中藥發酵目錄●?
壹 發酵的概念及歷史
● 二 中藥生物轉化的反應類型
● 三 發酵工程的內容及發酵方式分類
● 四 根據發酵的目的把微生物發酵進行分類
● 五 發酵工程中常用的微生物
● 六 發酵培養基的組成
● 七 影響發酵的主要因素
● 八 中藥發酵的目的
● 九 發酵技術與中藥炮制
● 十 中藥的生物轉化的主要類型
● 十壹 發酵技術在中藥生產中的應用
● 十二 中藥的生物轉化案例
發酵的概念及歷史
● 發酵概念-人們將利用微生物的生命活動，以獲得微生物菌體或其代謝，轉化的產物的過程，叫發酵。
● 發酵的歷史
● 1 釀酒是最早的歷史。
● 2 19世紀到20世紀30年代，發酵產品如：乳酸，乙醇，丙酮，丁醇，澱粉酶，蛋白酶等。
● 3 1929年弗萊明發現了青黴素以來，抗生素的發酵生產為現代微生物發酵工程積累了豐富的經驗。
● 4 現代發酵工程生產了：幹擾素，白細胞介素，多種細胞生長因子，氨基酸，有機酸，維生素，酶制劑，基因工程藥物，微生物轉化發酵產品及其他生物活性物質。
● 據有關資料統計，通過發酵生產的抗生素品種多達200多個，某些發達國家，發酵工業占國民生產總值的5%。
生物轉化的反應類型● 生物轉化的實質是酶促反應，常用的反應類型如下：
● 1 氧化反應 單加氧 羥基化 環氧化 氨雜基團氧化 β-氧化 脫氫
● 2 還原反應 羰基還原 雜氮基團還原
● 3 水解反應 酯和內酯的水解 醚的水解和開裂 苷的水解 酰胺和內酰胺的水解 環氧水解 水解脫胺 水解胺烷基中烷基
● 4 縮合反應
● 5 胺化反應
● 6 酰基化反應
● 7 降解反應
● 8 脫水反應
● 9糖基化反應
發酵工程的內容及發酵方式分類
● 1 生產菌的選育。
● 2 發酵條件的優化與控制，生物反應器的設計。
● 3 發酵產物的分離，提取與精制過程。
● 根據發酵方式分為厭氣發酵和通氣發酵二大類。
● 厭氣發酵:乙醇發酵，酒類發酵，丙酮丁醇發酵，乳酸發酵和甲烷發酵等。
● 通氣發酵包括:酵母培養，有機酸發酵，抗生素發酵，氨基酸發酵，酶制劑的生產和多糖發酵等。
根據發酵的目的把微生物發酵進行分類● 壹 以獲得微生物菌為目的的發酵
● 發酵產生茯苓，香菇，冬蟲夏草，靈芝等藥用真菌；發酵產生白僵菌，綠僵菌，蘇雲金芽孢桿菌等菌體，用以制備生物殺蟲劑；以及傳統的發酵生產單細胞蛋白，酵母菌等。
● 二 以獲得酶制劑為目的的發酵
● 用於食品工業的澱粉酶，糖化酶，用於臨床檢測的膽固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶。
● 三 以獲得微生物的初級或次級代謝產物為目的的發酵
● 初級代謝產物：氨基酸，蛋白質，核酸，核苷酸，多糖。次級代謝產物：抗生素，生物堿，細菌毒素，植物生長因子。
● 四 以獲得低毒，高效的新物質為目的發酵
● 利用微生物的氧化，還原，脫水，脫羧，異構化等。比如把L-山梨醇轉化為L-山梨糖，葡萄糖轉化為葡萄糖酸。
發酵工程中常用的微生物● 壹 細菌-單細胞原核生物
● 大腸桿菌，醋酸桿菌，乳酸桿菌，丙酮丁醇梭菌，腸膜狀明串珠菌，雙歧桿菌，丁酸梭菌等。
● 二 放線菌
● 放線菌最大的經濟價值是能產生多種抗生素，如鏈黴素，土黴素，金黴素，紅黴素，氯黴素，爭光黴素，卡那黴素等。從自然界分離了5000多種抗生素，其中4000多種來自於防線菌。
● 1 鏈黴菌屬 多種鏈黴菌能產生抗生素，如灰色鏈黴菌產生的殺稻菌素S可用於稻瘟病的防治。
● 2 小單孢菌屬 如絳紅小單孢菌和棘孢小單孢菌都能產生慶大黴素。
● 3 若卡菌屬 如利福黴素，蟻黴素等。
● 4 遊動放線菌屬。
發酵工程中常用的微生物● 三 黴菌
● 黴菌是指在營養基上形成絨毛狀，網狀或絮狀菌絲的真菌，亦稱為絲狀真菌。大多為好氧微生物。生產乙醇，枸櫞酸，青黴素，澱粉酶，果膠酶，纖維素酶，蛋白酶，多糖和甾體激素等。
● 1 青黴屬
● A 產黃青黴 產生多種酶和有機酸。產生青黴素，葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸，枸櫞酸和抗壞血酸。
● B 桔青黴 桔青黴可以生產桔黴素，也可以產生脂肪酶，葡萄糖氧化酶和凝乳酶。
● 2 根黴屬
● 其澱粉酶的活性很高，可用作釀酒工業上的澱粉原質的糖化菌，在根黴中還含有酒化酶。根黴能產生有機酸：反二烯丁酸，乳酸，琥珀酸和芳香的酯類物質。
● A黑根黴 產生反丁烯二酸和果膠酶。
● B米根黴 酒藥和酒曲中常見到。該菌有澱粉糖化，蔗糖轉化等性能。能產生乳酸，反丁烯二酸。
● C 華根黴 產生乙醇，芳香酯類等。它是釀酒所必需的主要黴菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生產中的主要菌種。
發酵工程中常用的微生物● 3 曲黴屬
● A 黑曲黴 具有多種活性強大的酶系，可以生產酸性蛋白酶，澱粉酶，果膠酶，葡萄糖氧化酶，還能產生多種有機酸，如抗壞血酸，枸櫞酸葡萄糖酸和沒食子酸。
● B 米曲黴 含有多種酶類，具有較強的蛋白分解能力，又有糖化能力，很早用於醬油和醬類生產。是蛋白酶和澱粉酶的生產菌。
● 4 紅曲屬 紅曲能產生澱粉酶，蛋白酶，枸櫞酸，琥珀酸，乙醇，麥角甾醇，該菌株可以生產紅曲紅素和紅曲黃素，最適PH3.5-5.0。用紫紅曲黴支撐的中藥紅曲，具有消食活血，健脾胃的功效。
發酵工程中常用的微生物● 酵母是單細胞真核微生物，主要分布於含糖質較多的偏酸性環境中。酵母菌落多呈乳白色，常用
有酵母屬和假絲酵母屬。
● 1酵母屬 常用的是啤酒酵母。其菌體的維生素，蛋白質含量高。也可以用來提取核酸，麥固醇，谷胱甘肽，細胞色素C，凝血素，輔酶A和ATP。
● 2 假絲酵母屬 常見的有產朊假絲酵母，解脂假絲酵母，熱帶假絲酵母等。
● 產朊假絲酵母其蛋白質和維生素的含量比啤酒酵母高。
● 解脂假絲酵母，不發酵任何糖，能分解脂肪。
● 熱帶假絲酵母，氧化烴類的能力很強，以石油為原料生產單細胞蛋白的重要菌種。
● 3 紅酵母屬
● 有較好的產生脂肪的能力，有的中具有對烴類的弱氧化作用，並能合成β-胡蘿蔔素。
發酵培養基的組成
● 1 碳源 氮源
● 2 無機鹽和微量元素
● 3 生長因子 水
● 4 代謝產物的前體，誘導物和促進劑。
● 營養成分的適當配比，PH值的調控（緩沖劑和不溶性的碳酸鹽），滲透壓和培養基的氧化還原電位。
影響發酵的主要因素
●1 溫度 PH 溶氧 泡沫
中藥發酵的目的● 壹 充分釋放中藥的有效成分
● 1 植物細胞壁由纖維素，半纖維素，果膠質，木質素等構成致密結構。用纖維素酶和果膠酶，可以破壞細胞壁的致密結構，釋放有效成分。
● 二 為天然藥物的生產提供了新的有效途徑--結構修飾與定向合成
● 1 把生源關系相近或結構類似的化合物轉化為特定的天然化合物；把資源豐富，活性較低的次生代謝生物轉化為人類需要的稀有，昂貴的天然藥物。如朱大元，余佰陽等發現多種微生物能定向地把喜樹堿轉化成10-羥基喜樹堿。大連輕工學院的金教授利用糖苷水解酶，將人參皂苷Rb1等轉化成含量只有十萬分之幾的人參皂苷Rh2和Rg3。
● 2 為天然藥物結構修飾與設計提供了新的工具-獲得新的高活性物質
● 利用化學法進行結構修飾獲得高活性新化合物，費時，費力，且存在得率低，反應轉壹性差，副產物多等缺點。生物轉化就沒有上訴缺點。
中藥發酵的目的● 三 結合藥物篩選，為新藥開發提供了研究手段
● 把中藥的生物轉化與高效快速藥物篩選手段結合，尋找到新的高活性或低毒性的天然活性先導化合物。
● 四 提高天然活性成分的生物利用度。
● 較高純度的天然活性成分往往溶解度差或體內吸收不好，造成天然活性成分常常在體內外藥效學活性差異較大，而生物轉化可以在解決此類問題的過程中發揮更大作用。
● 比如余佰陽利用微生物轉化手段在青蒿素及其衍生物蒿甲醚，雙輕青蒿素結構中引入羥基，增加了水溶性，而其抗瘧作用活性中心過氧橋沒有發生任何改變。
● 5 生物轉化是除去復方中藥制劑中大分子雜質的有效方法。比如利用水解蛋白酶去除蛋白質雜質，使出糖得出率大大提高，反之可以利用合適的酶去除糖類雜質。
發酵技術與中藥炮制● 中藥常用的發酵方式有二種:
● 1 直接用藥材進行發酵：淡豆豉 百藥煎 豆黃等。
● 2 用藥材和面粉混合發酵：六神曲 建神曲 半夏曲 沈香曲等。
● 目的：增效，減毒，產生新的活性成分。
● 中藥發酵研究中的難點與關鍵問題
● 1 中藥自身體系的模糊性及中藥成分的復雜性。
● 2 發酵理論的發展與完善 .
● 3 中藥發酵機制的不明確性：中藥化學成分復雜，作用機制不明確，中藥的有效成分，壹些非有效成分及特殊基質環境與微生物的相互作用尚待研究。
● 4 微生物生長特性的多樣性。
中藥的生物轉化的主要類型
●壹 生物堿的微生物轉化 喜樹堿變成10-羥基喜樹堿。
●二 萜類化合物的微生物轉化
●三 甾體化合物的微生物轉化
●四 黃酮類化化合物的微生物轉化
發酵技術在中藥生產中的應用● 中藥的液體深層發酵
● 壹 蟲草菌絲體的液體深層發酵生產
● 二 靈芝菌絲體的液體深層發酵生產
● 三 中藥紅曲的液體深層發酵生山
● 中藥的固體發酵生產
● 槐栓菌的固體發酵生產
● 紅曲的固體發酵生產
● 中藥的有效成分發酵
● 1993年，美國人從紅豆杉的樹皮中分離到壹種真菌，能直接生產紫杉醇。
● 曾金鳳等分離獲得了能夠產生人參皂苷的壹個青黴菌株，並以發酵的方式獲得了人參皂苷。
微生物發酵炮制何首烏● 何首烏抗衰老，調節機體免疫力，降血脂，抗動脈粥樣硬化，促進腎上腺皮質功能，其
主要成分為二苯乙烯苷類和蒽醌類化合物，後者被認為是何首烏致瀉和肝毒性的主要成分。
● 杜晨輝等用米根黴發酵何首烏，把大黃素轉化為大黃素-6-0-β-D-吡喃葡萄糖苷，從而降低了何首烏的瀉下作用。在發酵過程中，將蒽醌類成分降解或生產毒性較低的化合物，符合：增效減毒的中藥炮制目的。
中藥刺五加的發酵炮制● 刺五加，扶正固本，補腎健脾，益智安神。
● 陳麗艷等用猴頭菇炮制刺五加，實現了苷類成分的體外轉化，有利於人體吸收；發酵後多糖含量大幅提高，增加了藥效；同等劑量下，發酵物多糖的抗疲勞指標顯著增強。
● 白玉海等用側耳菌發酵刺五加，其發酵後的提取液能提高小鼠耐缺氧，抗疲勞，抗高溫和抗低溫的能力；同等劑量發酵後的刺五加提取液其抗應激作用增強。因此經側耳菌發酵後可使有效成分生物利用度提高，藥效增強。
微生物發酵炮制紅花
● 紅花作為壹味活血通絡，祛瘀止痛之良藥，具有降血脂和抗血栓等作用，且具有較強的抗氧化作用。紅花中抗氧化的有效成分是具有酚羥基的黃酮類化合物，如紅花黃色素，紅花素和槲皮素等。
● 馮誌華等研究地衣芽孢桿菌C2-13發酵炮制對紅花抗氧化活性的影響。發現紅花經C2-13發酵炮制其抗氧化功能顯著提高。HPLC分析還觀察到紅花中壹些成分發生了改變。
五倍子的發酵炮制
● 五倍子含有鞣質，沒食子酸等，有收斂止瀉，止血的作用。收斂止瀉作用主要是它含的鞣酸與細胞中的蛋白質結合成不溶於水的的沈澱物，從而抑制了細胞分泌，促進水液的再吸收而發揮收斂作用。但鞣酸在腸道內會遇到食物中的蛋白，並與之結合，因而降低了它的作用。
● 王和英根據酶學的有關理論，用根黴菌發酵五倍子，增強了五倍子的收斂作用。
黃芩的生物炮制
● 陳麗艷等研究發現，黃芩經黑曲黴發酵後，黃酮類成分發生變化，其黃芩苷的含量減少，而黃芩素和漢黃芩的含量分別是黃芩材料的2.73,5.77倍，提高了生物利用度和藥理活性。
雷公藤甲素的生物轉化● 雷公藤應用於治療類風濕關節炎，腎小球腎炎，紅斑狼瘡等，但雷公藤因為腎毒性大，
應用受到限制。因此，生物轉化，以期得到高效低毒的衍生產物。
● 1 用短刺小克銀漢黴對雷公藤甲素（1-6）進行生物轉化，得到7個產物，5-羥基雷公藤甲素（1-8），16-羥基雷公藤甲素（1-12）等。
● 2 雷公藤內酯酮的生物轉化
● NING等利用黑曲黴對雷公藤內酯酮進行了轉化，獲得了四個產物：17-羥基雷公藤內酯酮（1-15），16-羥基雷公藤內酯（1-16）等。
蟾毒配基類● 蟾酥主要成分為蟾毒精（1-23），蟾毒靈(1-24)及脂蟾毒配基含量最高。主要作用:抗休
克，抗病毒，抗腫瘤活性。
● 1 果德安教授對蟾酥的3種成分進行了微生物轉化，得到了進40個轉化產物，其中23個為新化合物。
● 篩選了20余株真菌及細菌對華蟾毒精進行了轉化，最後發現選擇鏈格孢對蟾毒精進行轉化，底物轉化效率高，產物也較多。
● 2 應用細胞毛黴對脂蟾毒配基進行生物轉化，獲得了7個轉化產物，11β-羥基-脂蟾毒配基（1-44)等。
大黃蒽醌類的生物轉化
● 大黃富含大黃素，大黃酸，大黃酚，大黃甲醚，蘆薈大黃素等蒽醌類化合物，是重要的致瀉和抗菌活性成分。
● 1 張薇等利用微生物轉化對大黃中的遊離蒽醌類化合物進行結構修飾。篩選了21種微生物對大黃酚（1-54），大黃素甲醚（1-55),大黃素（1-56）進行了轉化研究，最後確認：刺囊毛黴對大黃酚，大黃素甲醚，大黃素具有轉化作用。
● 刺囊毛黴使大黃酚，大黃素甲醚糖苷化，對大黃素的轉化是形成甲羥基轉化物，β-羥基大黃素。
麻黃堿的生物轉化● 麻黃堿又叫麻黃素，其差向異構體L-麻黃堿和d-偽麻黃堿是著名中藥麻黃的主要活性成分。麻黃
堿屬擬腎上腺激動藥物，用於支氣管哮喘，咳嗽，過敏，低血壓等，還具有松弛平滑肌，收縮血管，加速心率，升高血壓及中樞神經興奮作用。偽麻黃堿為擬交感神經藥，對收縮上呼吸道粘膜血管作用與麻黃堿相當，升壓作用只有L-麻黃堿壹半，對心血管和中樞神經系統興奮作用明顯弱於麻黃堿，但其加快心率，升高血壓，中樞興奮等不良反應較輕，且具有顯著的利尿作用。臨床上含麻黃堿與偽麻黃堿治療感冒的復方中藥很多：白加黑，新康泰克，銀德菲，諾泰感冒片，治療咳嗽的中成藥喘寧膠囊，小兒止咳糖漿。
● 二 常規生產方式：
● 1 植物提取法。2 直接化學合成法，成本較高。印度，美國，澳大利亞，捷克等國家生產的麻黃堿大都是利用化學方法合成的。3 半生物合成法 :采用酵母細胞生物催化法將丙酮酸與苯甲醛縮合形成L-苯基乙酰甲醇，然後再經甲胺還原胺化即得L-麻黃堿。4 微生物直接轉化法：董世建等篩選得到可專壹性轉化前體物質1-苯基-2-甲氨基丙酮生成d-偽麻黃堿的菌株。
延胡索素的生化轉化
● 延胡索素為罌粟科植物延胡索塊莖的化學成分,含有20多種生物堿，主要有延胡索甲素，延胡索乙素，延胡索丙素等，總稱延胡索素。能和血散瘀，行氣止痛，具有鎮痛，鎮靜，安定及催眠作用。
● 其中延胡索乙素有優良的鎮痛，鎮靜，催眠藥物，低毒，安全，不成癮。
● 中國藥科大學余佰陽用鏈黴菌等10株菌進行篩選，發現灰色鏈黴菌可以轉化延胡索總堿，將延胡乙素（L-THP)轉化為左旋紫堇達明（L-CDL),後者的藥理作用明顯強於前者。
紫杉醇的微生物及酶法合成
● 紫杉醇的生物合成途徑目前已經基本明了，其生物合成途徑中多種酶的基因已經成功克隆，因此隨著生物技術的不斷發展，通過微生物及酶法實現大規模生產紫杉醇及其類似物終將實現。
紫衫醇是昂貴的抗癌中藥，多烯紫杉醇抗癌活性稍高於紫衫醇，並較易溶於水。
● 1 從青蒿中提取 2 青蒿的化學全合成，產率0.25%。3 青蒿的半合成 把青蒿酸通過八步化學反應，合成青蒿素。
● 4 青蒿的生物合成
● A 通過添加生物合成的前提來增加青蒿的產量。
● B通過對控制青蒿素合成的關鍵酶進行調控，或者加入某些酶的激活劑來提高酶的效率。
● C 利用分子生物學的手段將酶的基因克隆出來，在轉移到微生物中進行表達，達到通過基因工程菌發酵產生青蒿素。5 通過植物組織培養方法生產青蒿素。
● 青蒿素及其衍生物的生物轉化
● LEE等利用珊瑚色諾卡菌和產黃青黴菌轉化青蒿素，前者獲得去氧青蒿素，後者得到去氧青蒿素和3α-羥去氧青蒿素。
● 陳有根等利用微生物灰色鏈黴菌轉化青蒿素得到壹個新化合物9α-羥基青蒿素，該產品具有抗惡性瘧原蟲活性。
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皂苷類的生物轉化● 人參皂苷是人參的主要成分，人參皂苷均屬於三萜皂苷，可分為三類 :二醇型，三醇型，齊墩果酸
型。人們把含量好的皂苷成分轉化成稀有皂苷，人參稀有皂苷包括Rh2,Rh1,Rh3,Rg1,Rg3,Rg5，只存在於紅參和野山參中。其中Rh2,Rh1,Rh3具有高抗癌作用，Rg3具有軟化血管和抗癌的作用。稀有人參皂苷在紅參及野山參中的含量只有十萬分之幾。
● 1 金教授發現人參皂苷糖苷酶只有在惡劣條件下才才產生，於是用人參皂苷糖苷酶，把栽培參中含量較高的Rb,Re,Rd,Rg1等生產Rh2等人參稀有皂苷。現在大連生生綠谷工程公司投產。
● 2 人參皂苷Rg1 是人參的益智的主要成分，預防老年癡呆；強化心肌細胞保護和心臟功能；抗疲勞作用；對皮膚衰老也有壹定作用。但人參皂苷Rg1在人參中含量大約只有0.2%，而人參皂苷Re在人參中含量很高，且和人參皂苷Rg1的皂苷元相同，金教授利用微生物產生的皂苷-ɑ-屬李糖苷酶，去掉了人參皂苷Re的C6位末端的壹個α-鼠李糖苷酶，大量制備人參皂苷Rg1.
甘草皂苷的生物轉化
● 甘草皂苷是甘草中主要的生理活性成分，甘草皂苷失去2分子糖基得到甘草皂苷元，某些生理活性要強於甘草皂苷。
● 吳少傑等用生物轉化的方法，分別利用菌種為米曲黴39和黑曲黴UV-48酶水解法及液體發酵轉化法進行轉化，將甘草皂苷轉化為甘草皂苷元。
黃酮類的生物轉化
● 1 大豆異黃酮是大豆中含有的活性較高的生理活性物質。
● 大豆異黃酮***有12種異構體，分為遊離型的苷元和結合型的糖二類。天然苷類的分子結構並不是活性最佳的狀態，糖苷需要在大豆異黃酮糖苷水解酶的作用下轉化，才能被吸收。因此大豆異黃酮糖苷水解酶對開發富含大豆異黃酮苷元的保健食品意義重大。
● 謝明傑從酒曲中分離出壹株產大豆異黃酮糖苷水解酶活性較高的菌株。
黃酮類的生物轉化
● 2 異槲皮苷是植物界分布較廣的黃酮類物質，是蘆丁的衍生物，結構上只比蘆丁少壹個鼠李糖。異槲皮苷由於具有抗氧化作用，其藥理活性比蘆丁還要高。
● 蘆丁在自然界含量豐富，而異槲皮苷在自然界含量極低，只有萬分之壹或十幾萬之壹。
● 王侃等在自然界中篩選出壹種微生物菌株，該菌能生產水解蘆丁上鼠李糖苷健的酶。
紅景天苷的生物轉化
● 紅景天不但有抗缺氧，抗寒冷，抗疲勞，抗微波輻射等明顯功能，還具備增強註意力，提高工作效率，延緩機體衰老，防治老年疾病等功效。
● 金教授，以酪醇和葡萄糖為底物，采用分離的菌株發酵獲得的粗酶液為轉化酶，最終合成紅景天苷。
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